Science：七年追蹤，向華/李明團隊找到護衛CRISPR的「暗物質」—抗毒素RNA系統

來源|中科院微生物研究所 2020年10月，基於CRISPR-Cas9系統建立的基因組編輯技術獲得了「2020年度諾貝爾化學獎」。實際上，這一革命性生物技術起源於科學家們對微生物中一種特殊的免疫系統（即CRISPR-Cas系統）的研究。 CRISPR-Cas系統是在原核微生物（古菌和細菌）中廣泛存在的抗病毒（噬菌體）免疫系統。宿主菌通過將入侵病毒的特定DNA序列插入到其CRISPR結構中，可形成對該病毒的永久性「記憶」。這些記憶性序列（稱為spacer）可轉錄加工生成crRNA、指導CRISPR-Cas系統效應物（如Cas9或Cascade複合物）特異性識別和切割再次入侵的病毒，實現對該類病毒的適應性免疫。CRISPR-Cas系統豐富多樣的功能組分和核酸靶向機制，為人類提供了迄今最高效的基因組編輯技術（如CRISPR-Cas9系統）和基因檢測技術（如CRISPR-Cas13a系統），因此近十餘年來一直是生命科學研究的前沿。 CRISPR-Cas系統在微生物基因組中穩定性維持是其抗病毒功能實現的關鍵基礎。一方面，CRISPR-Cas系統具有自我免疫的風險，並可能阻礙有益外源基因的獲取，因此可對宿主細胞造成適合度代價（fitness cost）而可能在進化過程中頻繁丟失。另一方面，微生物宿主與其病毒的「軍備競賽」中，CRISPR-Cas系統也會成為病毒反攻（Anti-CRISPR）的目標而喪失功能。面對多重的進化壓力和適應性挑戰，CRISPR-Cas系統為何能在微生物中廣泛存在（存在於約90%的古菌和40%細菌中）並發揮其功能？在微生物宿主基因組中是否存在一類保護CRISPR-Cas功能但至今尚未被揭示的「暗物質」？這是科學家長期關注而又未能充分認識的前沿科學問題。 2021年4月30日，中國科學院微生物研究所向華/李明團隊在國際頂級學術期刊 Science 在線發表了題為：Toxin-antitoxin RNA pairs safeguard CRISPR-Cas systems 的研究長文。首次在自然界分布最廣泛的I型CRISPR-Cas基因簇內部發現了一類特殊的RNA「暗物質」：一類前所未見的對其偶聯的CRISPR-Cas系統具護衛功能的一對RNA的毒素-抗毒素（CreTA）系統。 由於CRISPR-Cas系統可利用RNA抗毒素CreA控制RNA毒素CreT的表達，使宿主菌無法丟失其CRISPR-Cas系統（對其「上癮」）。因為一旦CRISPR-Cas組分被破壞，就會誘導CreT毒素的表達，從而抑制甚或殺死該宿主菌，從而保護了CRISPR-Cas系統在細胞群體中的穩定存在。這一「成癮」機制的發現為理解CRISPR-Cas系統的穩定性維持和廣泛性分布提供了全新視角，同時該文還揭示了一大類前所未知、功能多樣的小RNA，開闢了一個全新的研究領域。早在2014年，向華/李明團隊即利用西班牙鹽盒菌（Haloarcula hispanica）及其病毒在國際上建立了第一個I型CRISPR系統的高效適應模型，揭示了CRISPR系統對病毒高效適應需要引發的規律，並深入解析了「引發適應」過程精細的分子機制，包括Cascade與crRNA的可塑性。在這一研究過程中，他們發現了一個奇怪的現象: 4個成簇的編碼 CRISPR效應複合物Cascade的基因（Cas6-Cas8-Cas7-Cas5）無法單獨敲除，但可以作為整體一起敲除，從而推測這個基因簇內部可能隱藏了一個未知的「細胞成癮」元件。經過近7年的探索，他們最終在Cas6與Cas8之間一段僅311 bp的基因間區內發現了一類全新的小RNA毒素-抗毒素系統，分別命名為CreT（RNA毒素）和CreA（RNA抗毒素）。CreTA通過與CRISPR效應複合物4個編碼基因的結構與功能的偶聯，守護了CRISPR-Cas系統的穩定性（圖1）。圖1-CRISPR-Cas系統與CreTA毒素-抗毒素系統的互作機制該研究的主要創新性發現： 1、首次發現受Cascade蛋白控制的小RNA毒素 該團隊首先通過敲除cas6和cas8基因間區的311 bp序列獲得ΔTA菌株，然後基於該菌株成功獲得了Cascade各單基因缺失菌株。接著，他們利用攜帶這一段311 bp基因間區的質粒（pTA）轉化各突變株，發現在Cascade基因缺失（Δcas5-8）或其單基因缺失（ΔTAΔcas5/6/7/8）的菌株中，pTA均表現出細胞毒性（轉化效率降低約4個數量級），而在Cascade基因完整表達的ΔTA菌株中，pTA的細胞毒性則被完全抑制。上述系列實驗表明，311 bp的基因間區產生了某種未知毒素，命名為Cascade抑制型毒素（Cascade-repressed Toxin），即CreT（圖2A和2B）。為確定CreT的具體序列，該團隊通過截短實驗發現CreT毒性來自於一段132bp的序列（圖2A中-54到 78），其中有一個典型的啟動子序列，可起始轉錄產生了一個78nt的小RNA。突變分析進一步表明，該啟動子及小RNA內部一段莖環結構的突變均導致CreT毒性的消失（圖2C），說明CreT是一種具有細胞毒性的小RNA分子。CreT 的誘導表達實驗進一步證明了其抑菌（bacteriostatic）而非殺菌（bactericidal）活性（圖2D和2E）。

圖2-CreTA在CRISPR-Cas基因簇中的位置及功能分析 2、解析了小分子RNA毒素CreT獨特的抑菌機制 對CreT RNA的精細序列和結構分析表明，其５"端具有強效的翻譯信號SD（Shine-Dalgarno）序列和AUG起始密碼，緊接其後的是兩個精氨酸稀有密碼子AGA, 隨後是終止密碼子UGA和一個莖環結構（圖３A）。系列突變實驗表明，上述關鍵序列和結構都是CreT毒性所必需。基於此，該團隊推斷了一個全新的分子迴路，即CreT RNA藉助強效的翻譯起始信號定位在核糖體上，然後通過兩個串聯的稀有密碼子AGA進一步劫持胞內稀有的精氨酸tRNAUCU，從而抑制了胞內其它重要蛋白的翻譯合成和細胞生長。基於這一猜想，他們通過過表達tRNAUCU成功解除了CreT的細胞毒性（圖３B），證實了這一全新的毒性機制，即CreT 是通過其RNA劫持胞內稀有的精氨酸tRNA發揮毒性，而非翻譯產生含二精氨酸的小肽發揮作用，因此CreT是一類小RNA毒素。

圖３-CreT毒素通過劫持胞內稀有的精氨酸tRNAUCU抑制菌體生長 3、發現CreA抗毒素——類似crRNA的小分子RNA 為揭示Cascade蛋白抑制CreT毒性的分子機制，該團隊首先敲除了胞內唯一的CRISPR array結構，從而排除了CRISPR array來源的crRNA參與毒性抑制的可能性。對311bp基因間區的截短與突變實驗表明，creT下游序列為毒性抑制所必需（圖２C）。精細的序列分析和Northern印跡等實驗表明，creT下游有一段與CRISPR repeat高度相似的序列（圖2A），該序列及其下游序列可獨立轉錄產生一個約90nt的前體RNA，並被Cas6加工為一個的成熟的小RNA（圖４A）。該小RNA約41nt，含有與crRNA一樣的完整的5" handle序列（8 nt），特定的spacer序列（約33nt），但缺乏crRNA常見的3" handle，因此命名為「類crRNA抗毒素」（CrRNA-resembling Antitoxin），簡稱CreA。CreA作為crRNA類似分子，即可能聯合Cascade蛋白對CreT毒素活性發揮抑制作用。

圖４-CreA模擬crRNA指導Cascade特異性抑制creT啟動子 ４、揭示CreA RNA聯合Cascade發揮抗毒素活性的分子機制 該團隊進一步揭示，與crRNA介導Cascade複合物識別外源靶序列一樣，CreA介導Cascade精確識別creT啟動子（圖4B）。CreA種子序列區（5" handle 後約11nt）與creT啟動子完全匹配（除不參與鹼基匹配的第６個核苷酸外），而其餘大部分序列不匹配。對CreA的5" handle序列和種子序列區的突變、以及對保守PAM（protospacer adjacent motif）序列的突變，都將導致CreA對 creT啟動子抑制活性的喪失，進一步證明CreA聯合Cascade實現了對CreT的轉錄水平調控，從而在正常情況下可抑制CreT的表達及毒性。特別需要指出的是，該團隊早期實驗已經揭示了crRNA的高度可塑性，其結構（如是否含有3" handle序列）及spacer與靶序列匹配長度的不同，可以指導Cascade對外源靶標DNA實現干擾或引發適應兩種不同的生理效應。本研究進一步發現CreA與creT基因啟動子序列之間的不完全匹配性指引了多亞基Cascade效應物結合併抑制毒素啟動子的活性，從而實現對毒素基因的轉錄水平調控，這在國際上首次揭示了多亞基CRISPR效應物固有的基因調控生理功能。 ５、揭示CreTA對CRISPR-Cas系統的護衛功能 通過研究在有無CreTA存在時，活躍的可移動元件IS（insertion element）對cascade基因的破壞行為，該團隊進一步證實了CreTA作為一個極簡的「成癮」元件保護CRISPR-Cas系統的生理功能（圖5）。當CreTA存在時，可以保證Cascade基因（cas6-cas8-cas7-cas5）不被可移動元件插入失活，而當CreTA丟失後，由於CRISPR-Cas系統固有的適合度代價，Cascade基因被IS元件頻繁破壞。圖5-CreTA保護Cascade基因簇的遺傳穩定性 6、揭示CreTA 同源或類似系統在不同微生物和不同CRISPR亞型中的普遍存在該團隊還通過深入挖掘現有的微生物基因組數據，並與美國NCBI生物信息領域知名專家Eugene V Koonin教授團隊合作，進一步發現多種古菌/細菌的不同類型CRISPR-Cas系統中潛藏著CreTA類似物，暗示CRISPR-Cas可能普遍利用CRISPR效應物固有的基因調控功能（如抑制一個毒性RNA的轉錄）對沖其適合度代價。這一全新機制的發現從新的視角解釋了CRISPR-Cas在微生物中的廣泛分布。值得特彆強調的是，已知的毒素-抗毒素（TA）系統都編碼一個毒素蛋白，而該工作發現的CreTA利用了一個極簡的小RNA（CreT）作為毒素組分，而且其抗毒素（CreA）也是一個小RNA，並依賴於Cascade複合物發揮功能，因此，CreTA或可定義一個新的TA分類單元。更重要的是，這類系統全新的分子機製為基因工程和基因編輯等應用提供了重要的元件和啟示，例如，該團隊一方面已利用CreT開發了可在細菌和古菌中通用的極簡的反向篩選標記，為基因工程提供了新元件；另一方面基於CreA調控creT轉錄的分子迴路開發了同步實現基因編輯和基因調控的新技術（均已申請專利）。該發現不僅在CRISPR-Cas及其偶聯繫統生物學研究中具有里程碑意義，而且為研究原核微生物「非編碼RNA暗物質世界」敞開了一道門。該論文指出在不同古菌和細菌不同類型的 CRISPR-Cas系統中發現的CreTA類似物在序列上多樣性豐富，可能蘊藏了大量未知的毒性機制和功能元件。因此，這類豐富多樣的「暗物質」的深入發掘將進一步推動生物技術的發展，包括對未來小RNA藥物的研製或將具有啟發意義。中國科學院微生物研究所向華研究員和李明研究員為該論文的共同通訊作者，李明研究員、向華研究組博士後龔路遙和博士生程飛躍為並列第一作者。美國國立衛生研究院（NIH）生物技術信息中心（NCBI）Eugene Koonin教授及其團隊給予了重要幫助。向華研究員自2009 年獲得國家傑出青年科學基金項目資助開始CRISPR-Cas系統的前沿研究，現為微生物資源前期開發國家重點實驗室主任、微生物研究所副所長、國家重大研究計劃重點項目負責人、國家重點研發計劃項目首席科學家。李明於2009年進入向華實驗室碩博連讀並專註於CRISPR研究，於2020年獲得國家優秀青年項目資助，現為中國科學院微生物生理與代謝工程重點實驗室青年課題組長。該工作得到了中科院戰略先導研究計劃、國家重點研發計劃、國家自然科學基金、國家轉基因重大科技專項、中國科協青年人才托舉工程、中國科學院青年創新促進會等項目的支持。 論文鏈接： https://science.sciencemag.org/content/372/6541/eabe5601