Science:七年追蹤,向華/李明團隊找到護衛CRISPR的「暗物質」—抗毒素RNA系統
圖3-CreT毒素通過劫持胞內稀有的精氨酸tRNAUCU抑制菌體生長 3、發現CreA抗毒素——類似crRNA的小分子RNA 為揭示Cascade蛋白抑制CreT毒性的分子機制,該團隊首先敲除了胞內唯一的CRISPR array結構,從而排除了CRISPR array來源的crRNA參與毒性抑制的可能性。對311bp基因間區的截短與突變實驗表明,creT下游序列為毒性抑制所必需(圖2C)。精細的序列分析和Northern印跡等實驗表明,creT下游有一段與CRISPR repeat高度相似的序列(圖2A),該序列及其下游序列可獨立轉錄產生一個約90nt的前體RNA,並被Cas6加工為一個的成熟的小RNA(圖4A)。該小RNA約41nt,含有與crRNA一樣的完整的5" handle序列(8 nt),特定的spacer序列(約33nt),但缺乏crRNA常見的3" handle,因此命名為「類crRNA抗毒素」(CrRNA-resembling Antitoxin),簡稱CreA。CreA作為crRNA類似分子,即可能聯合Cascade蛋白對CreT毒素活性發揮抑制作用。
圖4-CreA模擬crRNA指導Cascade特異性抑制creT啟動子 4、揭示CreA RNA聯合Cascade發揮抗毒素活性的分子機制 該團隊進一步揭示,與crRNA介導Cascade複合物識別外源靶序列一樣,CreA介導Cascade精確識別creT啟動子(圖4B)。CreA種子序列區(5" handle 後約11nt)與creT啟動子完全匹配(除不參與鹼基匹配的第6個核苷酸外),而其餘大部分序列不匹配。對CreA的5" handle序列和種子序列區的突變、以及對保守PAM(protospacer adjacent motif)序列的突變,都將導致CreA對 creT啟動子抑制活性的喪失,進一步證明CreA聯合Cascade實現了對CreT的轉錄水平調控,從而在正常情況下可抑制CreT的表達及毒性。 特別需要指出的是,該團隊早期實驗已經揭示了crRNA的高度可塑性,其結構(如是否含有3" handle序列)及spacer與靶序列匹配長度的不同,可以指導Cascade對外源靶標DNA實現干擾或引發適應兩種不同的生理效應。本研究進一步發現CreA與creT基因啟動子序列之間的不完全匹配性指引了多亞基Cascade效應物結合併抑制毒素啟動子的活性,從而實現對毒素基因的轉錄水平調控,這在國際上首次揭示了多亞基CRISPR效應物固有的基因調控生理功能。 5、揭示CreTA對CRISPR-Cas系統的護衛功能 通過研究在有無CreTA存在時,活躍的可移動元件IS(insertion element)對cascade基因的破壞行為,該團隊進一步證實了CreTA作為一個極簡的「成癮」元件保護CRISPR-Cas系統的生理功能(圖5)。當CreTA存在時,可以保證Cascade基因(cas6-cas8-cas7-cas5)不被可移動元件插入失活,而當CreTA丟失後,由於CRISPR-Cas系統固有的適合度代價,Cascade基因被IS元件頻繁破壞。
圖5-CreTA保護Cascade基因簇的遺傳穩定性 6、揭示CreTA 同源或類似系統在不同微生物和不同CRISPR亞型中的普遍存在 該團隊還通過深入挖掘現有的微生物基因組數據,並與美國NCBI生物信息領域知名專家Eugene V Koonin教授團隊合作,進一步發現多種古菌/細菌的不同類型CRISPR-Cas系統中潛藏著CreTA類似物,暗示CRISPR-Cas可能普遍利用CRISPR效應物固有的基因調控功能(如抑制一個毒性RNA的轉錄)對沖其適合度代價。這一全新機制的發現從新的視角解釋了CRISPR-Cas在微生物中的廣泛分布。 值得特彆強調的是,已知的毒素-抗毒素(TA)系統都編碼一個毒素蛋白,而該工作發現的CreTA利用了一個極簡的小RNA(CreT)作為毒素組分,而且其抗毒素(CreA)也是一個小RNA,並依賴於Cascade複合物發揮功能,因此,CreTA或可定義一個新的TA分類單元。更重要的是,這類系統全新的分子機製為基因工程和基因編輯等應用提供了重要的元件和啟示,例如,該團隊一方面已利用CreT開發了可在細菌和古菌中通用的極簡的反向篩選標記,為基因工程提供了新元件;另一方面基於CreA調控creT轉錄的分子迴路開發了同步實現基因編輯和基因調控的新技術(均已申請專利)。 該發現不僅在CRISPR-Cas及其偶聯繫統生物學研究中具有里程碑意義,而且為研究原核微生物「非編碼RNA暗物質世界」敞開了一道門。 該論文指出在不同古菌和細菌不同類型的 CRISPR-Cas系統中發現的CreTA類似物在序列上多樣性豐富,可能蘊藏了大量未知的毒性機制和功能元件。因此,這類豐富多樣的「暗物質」的深入發掘將進一步推動生物技術的發展,包括對未來小RNA藥物的研製或將具有啟發意義。 中國科學院微生物研究所向華研究員和李明研究員為該論文的共同通訊作者,李明研究員、向華研究組博士後龔路遙和博士生程飛躍為並列第一作者。美國國立衛生研究院(NIH)生物技術信息中心(NCBI)Eugene Koonin教授及其團隊給予了重要幫助。 向華研究員自2009 年獲得國家傑出青年科學基金項目資助開始CRISPR-Cas系統的前沿研究,現為微生物資源前期開發國家重點實驗室主任、微生物研究所副所長、國家重大研究計劃重點項目負責人、國家重點研發計劃項目首席科學家。 李明於2009年進入向華實驗室碩博連讀並專註於CRISPR研究,於2020年獲得國家優秀青年項目資助,現為中國科學院微生物生理與代謝工程重點實驗室青年課題組長。該工作得到了中科院戰略先導研究計劃、國家重點研發計劃、國家自然科學基金、國家轉基因重大科技專項、中國科協青年人才托舉工程、中國科學院青年創新促進會等項目的支持。 論文鏈接: https://science.sciencemag.org/content/372/6541/eabe5601
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